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M5 Vac Endofree Hipure plasmid Maxi kit 抽滤法无内毒素质粒大提(适合抽滤,不离心)
货号 规格 销售价
MF876-01 10T 1398.00
  • 产品名称                                                        单位    货号

    M5 Vac Endofree Hipure plasmid Maxi kit   10T   MF876-01

     

    储存条件】  室温储存。

     

    产品简介

     

    内毒素是质粒提取中常见的污染物,由于真核细胞对内毒素非常敏感,因此,如果质粒中含有内毒素会大大降低真核细胞转染效率。本试剂盒提供一种快速、易大规模质粒制备的新方法。每次可处理100-300 ml菌液,获得多至2 mg转染级质粒DNA。使用真空装置可同时纯化多个样本,45分钟即可完成质粒提取,有效减少手动操作时间。特殊的缓冲液系统和除内毒素过滤器,有效去除内毒素、基因组DNA、RNA、蛋白等杂质。本试剂盒所得质粒纯度高、提取量大,特别适用于细胞转染,同时也可用于DNA测序,PCR,体外转录,内切酶消化等实验。

     

    推荐每次菌液使用量

     

    高拷贝质粒推荐使用量为100 ml,得率一般在500-1500 μg左右;最多可以处理300ml菌液。

    低拷贝质粒推荐使用量为200 ml,得率一般在50-300 μg左右;最多可以处理300ml菌液。

     

    产品组份

            10T                                 

    Buffer P1                                125 ml            

    Buffer P2                                125 ml             

    Buffer E3                                125 ml           

    Buffer PS                                 30 ml      

    Buffer PW (concentrate)                    50 ml        

    Endo-Free Buffer EB                       30 ml    

    RNase A (10 mg/ml)                         2 ml      

    Plungers                                  10个

    Endo-Remover FQ                         10个

    DNA-Binding Tubes                        10个

    VacConnectors                            10个           

    Centrifuge Tubes (50ml)                    20个

     

    自备试剂】 

     

    无水乙醇、异丙醇、真空泵、废液收集装置、真空纯化装置。

     

     

    实验前准备及重要注意事项】  请务必在使用本试剂盒之前阅读此注意事项!!!

     

    1.所有组分可在干燥、室温(15-30℃)环境稳定保存1年,将吸附柱置于2-8℃可保存更长时间,加入RNase A的Buffer P1 置于2-8℃可稳定保存6个月。

     

    2.Buffer P1 在使用前先加入RNase A(将试剂盒中提供的RNase A 全部加入),混匀,置于2–8℃保存。使用前需在室温中放置一段时间,恢复至室温后使用。

     

    3.第一次使用前应按照试剂瓶标签的说明在Buffer PW中加入无水乙醇。

     

    4.使用前请先检查Buffer P2 和Buffer E3是否出现结晶或沉淀,如有结晶或沉淀现象,可在37℃水浴几分钟,即可恢复澄清。

     

    5.注意Buffer P2和Buffer E3含有刺激性物质,请戴手套操作,使用后应立即盖紧盖子。

     

    6.使用Buffer PS处理过的吸附柱最好立即使用,避免放置时间过长影响使用效果。

     

    7.请准备废液收集装置/缓冲瓶MFE100、真空纯化装置MFE200、真空泵MFE300。

     

     

     

     

    操作步骤

     

    1.取100-300 ml过夜培养的菌液,加入离心管(自备)中,12,000×g离心2-3分钟收集细菌,尽量吸弃全部上清。

     

    2.向留有菌体沉淀的离心管中加入12 ml Buffer P1(请先检查是否已加入RNase A),使用移液器或涡旋振荡器充分混匀,悬浮细菌沉淀。

     

    注意:如果菌块未彻底混匀,将会影响裂解效果,使提取量和纯度偏低。

     

    3.向离心管中加入12 ml Buffer P2,温和地上下颠倒混匀8-10次,使菌体充分裂解,室温放置3-5分钟。此时溶液应变得清亮粘稠。

     

    注意:温和混匀,不要剧烈震荡,以免打断基因组DNA,造成提取的质粒中混有基因组DNA片段。如果溶液未变得清亮,提示可能菌量过大,裂解不彻底,应减少菌体量。

     

    4.向离心管中加入12 ml Buffer E3,立即上下颠倒混匀8-10次,此时出现白色絮状沉淀,室温放置5分钟。将溶液全部倒入除内毒素过滤器(Endo-Remover FQ)中,慢慢推动推柄(Plungers)过滤,滤液收集在干净的50 ml离心管(Centrifuge Tubes)中。

     

    注意:1Buffer E3 加入后应立即混匀,避免产生局部沉淀。

     

    2)加入E3后,若出现沉淀过多的情况,可12,000×g离心10分钟后,再将上清溶液倒入除内毒素过滤器中。

     

    5.向滤液中加入0.3倍滤液体积的异丙醇,上下颠倒混匀。

     

    注意:加入异丙醇过多容易导致RNA污染

     

    6.正确连接负压装置,将连接管(VacConnectors)与DNA吸附柱(DNA-BindingTubes)连接好后插到负压装置的插口上。

     

    注意:确保连接管和吸附柱连接稳固,防止发生漏气。

     

    7.柱平衡:向DNA吸附柱(DNA-Binding Tubes)中加入2 ml Buffer PS,开启并调节负压至-300~-700 mbar,吸去柱上溶液。

     

    8.将步骤5中滤液与异丙醇的混合溶液转移到平衡好的吸附柱中,吸去柱上溶液。

     

    9.向DNA吸附柱(DNA-Binding Tubes)中加入10 ml Buffer PW(请先检查是否已加入无水乙醇),吸去柱上溶液。

     

    重复步骤9。

     

    11.保持负压抽吸10分钟,除去吸附膜内残留漂洗液,干燥吸附膜。若一次抽吸6个样品以上,可将负压抽吸时间适当延长。待吸附膜彻底干燥后,关闭负压开关。

    注意:1)这一步的目的是将吸附柱中残余的乙醇去除,乙醇的残留会影响后续的酶促反应(酶切、PCR等)。

     

    2)根据吸附膜干燥情况,决定负压装置抽吸时间。如未彻底晾干,也可增加烘干步骤,65℃烘干30 min以彻底晾干吸附膜内残余的溶液。

     

    12.将压力恢复至0 mbar时,取下吸附柱,将DNA吸附柱置于一个新的50 ml离心管(Centrifuge Tubes)中,向吸附膜的中间部位加入1-3 ml Endo-Free Buffer EB,室温放置2-5分钟,12,000×离心5分钟,将质粒溶液收集到离心管中。-20℃保存质粒。

     

    注意:1)为了增加质粒的回收效率,可将得到的溶液重新加入到DNA吸附柱(DNA-BindingTubes)中,室温放置2-5分钟, 12,000×g离心5分钟,将质粒溶液收集到离心管中。

     

    2)质粒拷贝数较低或>10 kb时,Endo-Free Buffer EB6570℃水浴预热,可以增加提取效率。

     

     

     

     

    质粒DNA浓度及纯度检测

     

    得到的质粒DNA可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。OD260值为1相当于大约50 μg/ml双链DNA。纯化的质粒DNA OD260/OD280通常在1.8-2.0左右,可直接应用于细胞转染甚至动物体内实验等对DNA纯度要求很高的实验中。

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    备注

    本产品仅供科研使用。在确认产品质量出现问题时,本公司承诺为客户免费更换等量的质量合格产品。