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M5 HiperScript II Reverse Transcriptase(反转录酶II)(最高可以50度,12-13kb)
货号 规格 销售价
MF309-01 10000U 768.00
MF309-05 5x10000U 2880.00
  • M5 HiperScript II Reverse Transcriptase

    使用说明书

     

    产品名称                      单位        货号

    M5 HiperScript II Reverse Transcriptase   10000U     MF309-01

    M5 HiperScript II Reverse Transcriptase   5×10000U   MF309-05

     

     

    储存条件

     

    长期保存,请置于-20˚C,有效期24个月。

     

     

    产品简介

     

    M5 HiperScript II Reverse Transcriptase是基因工程改造后的M-MLV反转录酶(莫洛尼氏鼠白血病病毒pol基因),降低了RNA酶H活性,增强了热稳定性。该酶可以用来合成cDNA第一链,同传统的M-MLV RT相比,该酶在温度升高(最高可达65°C)时有更好的特异性,cDNA的产量更高。M5 HiperScript II Reverse Transcriptase可合成cDNA的最高长度达12 kb。

     

     

    单位定义

     

    1单位指以poly(A)为模板、oligo(dT)25为引物,在37°C条件下,10分钟内催化1 nmol的dTTP掺入形成酸不溶性沉淀物所需要的酶量。

     

     

    产品组分

                                                MF309-01        MF309-05

    M5 HiperScript II Reverse Transcriptase (200U/μl)       50 μl           5x 50 μl

    5× M5 HiperScript II RT Buffer                       1000 μl         5x1000 μl

    0.1M DTT                                          500 μl          5x500 μl

     

    贮存溶液:20 mM Tris-HCl (pH 7.5 @ 25°C),100 mM NaCl,0.1 mM EDTA,1 mM Dithiothreitol (DTT),0.01% Nonidet TM P-40 (NP-40) (V/V),50%甘油(V/V)。

     

     

    适用范围

     

    合成cDNA第一链,用于RT-PCR和实时RT-qPCR, 用于克隆和表达研究。

     

    制备带标记的cDNA探针,用于microarray研究;DNA标记和引物延伸法分析RNA。

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    【使用方法】

     

    A.第一链cDNA的合成:(以下20 μl的反应体系可以用于反转录1 ng-5 μg总RNA或1-500 ng mRNA)

     

    1. 将以下组分加入无核酸酶的微量离心管中:

    1 μl  oligo(dT)12-18(500 μg/mL)或50-250 ng随机引物或2 pmole基因特异性引物

    1 ng-5 μg 总RNA或1-500 ng mRNA

    1 μl 10 mM dNTP混合物 (dATP,dGTP,dCTP和dTTP均为10 mM)

    加入灭菌蒸馏水至12 μl

     

    1. 混合物在65°C加热5分钟后,迅速置于冰上。短暂离心收集组分后,加入:

    4 μl  5× M5 HiperScript II RT Buffer

    2 μl  0.1 M DTT

    1 μl  RNase抑制剂*(40 U/μl)。

     

    *注:RNase抑制剂不随酶附送,需要单独采购。如果起始RNA的量小于50 ng,则必须加入RNase抑制剂。

     

    1. 用枪头反复吸打混匀组分,若使用oligo(dT)12-18引物,应42°C下孵育2分钟;若使用的是随机引物,应在25°C下孵育5分钟。

     

    1. 加入1 μl M5 HiperScript II Reverse Transcriptase (200U/μl)轻轻上下颠倒混匀。如果您使用的RNA不足1 ng,减少M5 HiperScript II Reverse Transcriptase (200U/μl)添加量至0.25 μl,并加入无菌蒸馏水至终体积为20 μl。

     

    1. 42°C孵育50分钟。

     

    1. 70°C加热15分钟以终止反应。

     

     

    B.PCR反应体系和程序:

     

    1. 在PCR反应管中加入下列成分:

    10× Taq PCR缓冲液                                                5 μl

    50mM MgCl2                                                     1.5 μl

    10mM dNTP混合物                                               1.0 μl

    上游扩增引物 (10 μM)                                            1.0 μl

    下游扩增引物 (10 μM)                                            1.0 μl

    Taq DNA聚合酶 (5 U/μl)                                          0.4 μl

    2 μl cDNA (来自于第一链合成反应)                                 2.0 μl

    灭菌蒸馏水                                                     至50 μl

     

    1. 变性: 94°C加热2分钟。

     

    1. 进行15个到40个PCR循环。退火和延伸条件需要根据Taq DNA聚合酶而设定。

     

     

     

     

     

    备注

    本产品仅供科研使用。在确认产品质量出现问题时,本公司承诺为客户免费更换等量的质量合格产品。