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M5 HiPer Pfu DNA Polymerase 经典pfu酶
货号 规格 销售价
MF614-01 500U 268.00
MF614-05 5x500U 1128.00
  •                                                      

    M5 Pfu DNA Polymerase 使用说明书

     

    Product              Unit         Cat.#

    M5 Pfu DNA Polymerase        500U        MF614-01

    M5 Pfu DNA Polymerase       5x500U       MF614-05

     

    Storage】: Shipped at -20°C.

     

     

    产品介绍】:

     

    Pfu DNA Polymerase是通过大肠杆菌表达纯化的重组酶,具有5′-3′DNA聚合酶活性和3′-5′外切酶活性,因此在DNA扩增过程中具有纠错能力,其保真性是Taq DNA Polymerase的6-8倍。另外该酶与Taq DNA Polymerase相比具有更好的热稳定性,对于高GC含量模板,提高变性温度对它活性无影响。使用本产品扩增得到的PCR产物为平端,不能直接用于T/A克隆,如需进行T/A克隆则需要在其末端添加“A”或用平末端载体进行克隆。本产品适用于基因克隆、基因定点突变、SNP和末端补平等实验。

     

     

    产品组分】:

                                  MF614-01      MF614-05

    Pfu DNA Polymerase, 5 U/μl     100 μl         5x100 μl

    10×PCR Buffer                 1.0 ml         5x1.0 ml

     

    注意:本产品的10×PCR Buffer中含有25 mM镁离子。

     

     

    单位定义】:用活性化的大马哈鱼精子DNA作为模板/引物,在74℃,30分钟内,将10 nmol脱氧核苷酸掺入到酸性不溶物质所需的酶量定义为1个活性单位(U)。

     

    质量控制】:经过多次柱纯化,SDS-PAGE检测其纯度大于99%;经检测无外源核酸酶活性;PCR方法检测无宿主残余DNA;能有效地扩增人基因组中的单拷贝基因;室温存放一个月,无明显活性改变。

     

     

    操作步骤】:

     

    以下举例为以人基因组DNA为模板,扩增1 kb的片段的PCR反应体系和反应条件,实际操作中应根据模板、引物结构和目的片段大小不同进行相应的改进和优化。

     

    1. PCR反应体系

     

    试剂                          50 μl反应体系                  终浓度

    10×PCR Buffer                     5 μl                          1×

    dNTP Mix,10 mM each             1 μl                    200 μM each

    Forward Primer,10 μM             2 μl                       0.4 μM

    Reverse Primer,10 μM             2 μl                       0.4 μM

    Template DNA                  <0.5 μg                     <0.5 μg/50 μl

    Pfu DNA Polymerase, 5 U/μl        0.5 μl                      2.5U/50 μl

    ddH2O                       up to 50 μl

     

     

    注意:

    1)用Pfu酶扩增时,引物的纯度要求较高,引物长度大于18个碱基,引物浓度请以终浓度0.1-1.0μM作为设定范围的参考。扩增效率不高的情况下,可提高引物的浓度;发生非特异性反应时,可降低引物浓度,由此优化反应体系。

     

    2Pfu3′-5′外切酶活性可能降解引物,所以应先加dNTP后,再加Pfu酶到反应体系中,并立即进行PCR反应。

     

     

     

     

    1. PCR反应条件

     

    步骤             温度           时间

    预变性           94℃          2 min

     

    以下3个步骤循环25-35次:

    变性             94℃          30 s

    退火           55-65℃          30 s

    延伸             72℃          60 s

     

    终延伸           72℃          5 min

     

     

    注意:

     

    1Pfu酶的热稳定性比Taq酶好,对于GC含量很高的模板,变性温度可以提高到98℃,对Pfu酶的活性无影响。

     

    2)一般实验中退火温度比扩增引物的熔解温度Tm5℃,无法得到理想的扩增效率时,适当降低退火温度;发生非特异性反应时,提高退火温度,由此优化反应条件。

     

    3Pfu酶具有3′-5′外切酶活性,所以Pfu酶扩增时延伸速度远比Taq酶低,延伸时间根据所扩增片段大小设定,本产品的扩增延伸速率为1 kb/min

     

    4)可根据扩增产物的下游应用设定循环数。如果循环次数太少,扩增量不足;如果循环次数太多,错配机率会增加,非特异性背景严重。所以在保证产物得率的前提下应尽量减少循环次数。

     

    5)本产品具有3′-5′外切核酸酶活性,PCR产物3’端不带“A”,不能直接用于T/A克隆,如需进行T/A克隆则需要在其末端添加“A”或用平末端载体进行克隆。

     

    Please note: All products are "FOR RESEARCH USE ONLY AND ARE NOT INTENDED FOR DIAGNOSTIC OR THERAPEUTIC USE"