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M5 HiPer M-MuLV Reverse Transcriptase(MMLV反转录酶)
货号 规格 销售价
MF009-01 10000U 568.00
MF009-05 5x10000U 2680.00
  • M5 M-MuLV Reverse Transcriptase

    (RNase H-)使用说明书

     

    产品名称                  单位        货号

    M5 M-MuLV Reverse Transcriptase   10000U     MF009-01

    M5 M-MuLV Reverse Transcriptase   5×10000U   MF009-05

     

     

    储存条件

    长期保存,请置于-20˚C,有效期24个月。

     

     

    产品简介

    M5 M-MuLV Reverse Transcriptase (RNase H-) 是利用基因工程技术,对M-MuLV 反转录酶的基因进行定点突变改造后,通过原核重组表达、柱层析纯化得到的反转录酶,适用于常规反转录反应、RT-PCR扩增、实时定量RT-PCR等实验的第一链cDNA合成。经过多重定点突变的M-MuLV反转录酶不仅去除了RNase H酶活性,而且增加了该酶与模板-底物的亲和力,合成的cDNA产量更多、更长(可以高效合成长达13kb的全长第一链cDNA)。此外,该酶对于高温有更强的耐受性(在50˚C仍具有活性),可以使用较高的反转录反应温度,因此更好地克服了因模板RNA的二级结构而引起的反转录困难现象。

     

     

    单位定义

    活性单位的反转录酶定义为在42˚C、10分钟条件下,使1 nmol的脱氧核糖核酸掺入酸性沉淀物质所需的酶量.

     

    产品组分

    M5 M-MuLV Reverse Transcriptase (RNase H-) (200U/μl)      50 μl  

    5× M5 M-MuLV RT Buffer*                                 500 μl  

    (5× M5 M-MuLV RT Buffer 成分:250 mM Tris-HCl (pH 8.3 at 25°C), 375 mM KCl, 15 mM MgCl2, 50 mM DTT)

     

    适用范围

    合成cDNA第一链,用于RT-PCR和实时RT-qPCR, 用于克隆和表达研究。

    制备带标记的cDNA探针,用于microarray研究;DNA标记和引物延伸法分析RNA。

     

     

    【使用方法】

    A.<注意事项>

    实验过程中请注意避免 RNase 污染

    RNA模板的完整性对cDNA合成效率起着决定性作用,因此请选择可靠的RNA提取/纯化方法。建议使用聚合美M5 Total RNA Extraction Reagent(货号 MF034-01) 制备高质量的 RNA 模板,并设置反转录反应阳性对照。

    由于所有的 RNA 提取方法都不能完全去除基因组 DNA,所以应根据后续实验的需求,选择是否需要在反转录反应前去除残留基因组 DNA。RNase-free DNase I处理的具体方法见本说明书后面。

     M5 M-MuLV Reverse Transcriptase (RNase H-)以 RNA 为模板获得全长的第一链 cDNA,其起始位点由所用引物所决定:

    1) 随机引物(Random Primer)在 RNA 模板上没有特异性结合位点,所有 RNA 都可以做为第一链 cDNA 合成的模板;

    2) Oligo dT Primer 只能以 poly(A) mRNA 作为 cDNA 合成的模板;

    3) 采用序列特异性引物 (GSP) 以其结合位点为起始位点。

    M5 M-MuLV Reverse Transcriptase (RNase H-)合成的第一链 cDNA 产物可直接加入 PCR 反应混合物中进行扩增,但加入体积不应超过 PCR 反应总体系的 10%,否则影响目的片段的产量。PCR 扩增使用的耐热 DNA 聚合酶和热循环条件需要根据目的片段的大小、GC含量、引物特性、以及对保真度的要求等进行选择。

    第一链 cDNA 合成产物经过处理后可作为第二链合成的模板,合成含各种标记的 cDNA,作为杂交实验的探针。

    RNA 应置于-70˚C以下保存,cDNA 合成产物应置于-20˚C保存。

     

    B.<标准操作流程> (适于复杂模板或对扩增产量要求较高的实验)

    在 DNase/RNase-free 离心管中依次加入下列成分:

    1) RNA 模板:                    ≤8 µl (总 RNA 1~5 µg;poly(A) mRNA  0.1~0.5 µg)

    2) 引物:                           1µl(Oligo dT引物/Random引物50 μM; 引物/序列特异性引物50μM)

    3) 10 mM dNTP Mix:                1μl

    4) DEPC-ddH2O 补足至            14.5μl

    混匀,短暂离心,65˚C加热 5 分钟,打开 RNA 的二级结构;

    立即置于冰上至少 1 分钟,避免 RNA 的二级结构重新形成;

    向管中加入:

    5× M5 M-MuLV RT Buffer            4 μl

    RNase Inhibitor                   0.5 μl

    轻轻混匀,短暂离心;如果采用 Oligo dT 或序列特异性引物,42˚C温育 2 分钟;如果采用随机引物,25˚C温育 2 分钟;

    加入 1μlM5 M-MuLV Reverse Transcriptase (RNase H-),轻轻混匀;如果采用随机引物,25˚C温育 10 分钟;

    42˚C温浴 50 分钟;

    85˚C加热 5 分钟使酶失活;

    置于冰上进行后续实验或冷冻保存。

     

    <简化操作流程>(不适于复杂模板或对扩增产量要求较高的实验)

    在 DNase/RNase-free 离心管中加入下列成分:

    5× M5 M-MuLV RT Buffer           4 μl

    RNase Inhibitor                  0.5 μl

    10 mM dNTP Mix                  1 μl

    RNA 模板                      ≤8 μl (1~5 µg 总 RNA 或 0.1~0.5 µg poly(A) mRNA)

    引物                             1 μl (50 μM Oligo dT引物/ Random引物/20μM 序列特异性引物)

    M5 M-MuLV Reverse Transcriptase  1 μl

    DEPC-ddH2O             补足至 20 μl

    轻轻混匀,短暂离心; 42˚C温浴 50 分钟;

    85˚C加热 5 分钟使酶失活;马上置于冰上进行后续实验或冷冻保存。

     

    【补充说明】

    以下流程为选做步骤,请根据实验情况酌情选择

    1.RNase-free DNase I 处理 RNA 模板的方法:

    1) 在 DNase,RNase-free 离心管中加入下列试剂:

    RNA                         2-5μg

    10× DNase I buffer               1μl

    DNase I (2 U/μl)               0.5 μl

    RNase Inhibitor               0.25 μl

    DEPC-ddH2O           补足至 10 μl

    2) 混匀,短暂离心,37˚C放置 30 分钟;

    3) 加入 1 μl 50 mM EDTA,65˚C放置 15 分钟使 DNase I 失活;或者直接使用酚/氯仿抽提去除 DNase I;

    4) 为避免干扰反转录体系,RNA 加入量最好不超过反转录体系的 1/5,如果 RNA 浓度过低,建议沉淀浓缩后使用。

     

     

     

     

    备注

    本产品仅供科研使用。在确认产品质量出现问题时,本公司承诺为客户免费更换等量的质量合格产品。