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M5 HiperScript III Reverse Transcriptase(反转录酶III)(最高可以55度,12-13kb)
货号 规格 销售价
MF310-01 5x10000U 968.00
MF310-05 5x10000U 3180.00
  • M5 HiperScript III Reverse Transcriptase

    使用说明书

     

    产品名称                      单位        货号

    M5 HiperScript III Reverse Transcriptase   10000U     MF310-01

    M5 HiperScript III Reverse Transcriptase   5×10000U   MF310-05

     

     

    储存条件

     

    长期保存,请置于-20˚C,有效期24个月。

     

     

    产品简介

     

    M5 HiperScript III Reverse Transcriptase是基因工程改造后的M-MLV反转录酶(莫洛尼氏鼠白血病病毒pol基因),降低了RNA酶H活性,增强了热稳定性。由于M5 HiperScript III Reverse Transcriptase可以在高至55°C下合成cDNA第一链,从而能得到比其它的反转录酶特异性更好、产量更高的cDNA,并且更多的全长cDNA。M5 HiperScript III Reverse Transcriptase从100 bp到12 Kb以上的cDNA。

     

     

    单位定义

     

    1单位指以poly(A)为模板、oligo(dT)25为引物,在37°C条件下,10分钟内催化1 nmol的dTTP掺入形成酸不溶性沉淀物所需要的酶量。

     

     

    产品组分

                                                MF310-01        MF310-05

    M5 HiperScript III Reverse Transcriptase (200U/μl)       50 μl           5x 50 μl

    5× M5 HiperScript III RT Buffer                        500 μl          5x500 μl

     

    贮存溶液:20 mM Tris-HCl (pH 7.5 @ 25°C),100 mM NaCl,0.1 mM EDTA,1 mM Dithiothreitol (DTT),0.01% Nonidet TM P-40 (NP-40) (V/V),50%甘油(V/V)。

     

     

    适用范围

     

    合成cDNA第一链,用于RT-PCR和实时RT-qPCR, 用于克隆和表达研究。

     

    制备带标记的cDNA探针,用于microarray研究;DNA标记和引物延伸法分析RNA。

     

     

     

    质量检测

     

    核酸外切酶活性:50 μl反应体系中,500 U本酶与1 μg的pUC19质粒于37°C温育4小时,电泳条带无明显变化。

    核酸内切酶活性:50 μl反应体系中,2000 U本酶与1 μg的Hind III消化的λDNA于37°C温育4小时,电泳条带无明显变化。

    RNase活性:25 μl反应体系中,1000 U本酶与250 ng的大肠杆菌rRNA于37°C温育2小时,经琼脂糖电泳检测,被降解的rRNA小于1%。

    纯度:经SDS-PAGE (考马斯亮蓝染色) 检测其纯度大于90%。

     

     

     

     

    【使用方法】

    A.第一链cDNA的合成:(以下20 μl 的反应体系可以用于反转录10 pg-5 μg总RNA或10 pg-500 ng mRNA)

     

    1. 将以下组分加入无核酸酶的微量离心管中

    1 μl         oligo(dT)20(50 μM)或200–500 ng oligo(dT)12-18或50–250 ng随机引物或2 pmole基因特异性引物

    10 pg-5 μg   总RNA或10 pg-500 ng mRNA

    1 μl         10 mM dNTP混合物(dATP,dGTP,dCTP和dTTP均为10 mM,pH中性)

    加入灭菌蒸馏水至14 μl。

     

    1. 混合物在65°C加热5分钟后,迅速置于冰上冷却至少1分钟。

     

    1. 短暂离心收集组分后,加入:

    4 μl  5× M5 HiperScript III RT Buffer

    1 μl  RNase抑制剂(40 U/μl)*

    1 μl  M5 HiperScript III Reverse Transcriptase (200U/μl)**

     

    * RNase抑制剂不随酶附送,需要单独采购。如果起始RNA的量小于50 ng,则必须加入RNase抑制剂。

    ** 对于长cDNA片段(>5 kb),使用oligo(dT)20或基因特异性引物在50°C之上反应时,增加M5 HiperScript III Reverse Transcriptase (200U/μl)的用量至400U (2 μl)可以增加cDNA的产量。

     

    1. 用枪头反复吸打混匀组分,如果使用的是随机引物,应在25°C下孵育5分钟。

     

    1. 50°C孵育30-60分钟,如果使用基因特异性引物、复杂模板或富含二级结构的模板需将反应温度增加到55°C。

     

    1. 在70°C加热15分钟以终止反应。

     

    注意:cDNA产物可以直接作为PCR的模板。如果扩增的PCR产物大于1 kb,则需要去除与cDNA互补的RNA。可以使用1 μl(2 U)的E.coli RNA酶H在37°C孵育20分钟以去除与cDNA互补的RNA。

     

    B.PCR反应体系和程序:

    1. 在PCR反应管中加入下列成分:

    10× Taq PCR缓冲液                                                5 μl

    50mM MgCl2                                                     1.5 μl

    10mM dNTP混合物                                               1.0 μl

    上游扩增引物 (10 μM)                                            1.0 μl

    下游扩增引物 (10 μM)                                            1.0 μl

    Taq DNA聚合酶 (5 U/μl)                                          0.4 μl

    2 μl cDNA (来自于第一链合成反应)                                 2.0 μl

    灭菌蒸馏水                                                     至50 μl

     

    1. 变性: 94°C加热2分钟。

     

    1. 进行15个到40个PCR循环。退火和延伸条件需要根据Taq DNA聚合酶而设定。

     

     

     

    备注

    本产品仅供科研使用。在确认产品质量出现问题时,本公司承诺为客户免费更换等量的质量合格产品。