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M5 HiPer One-step Kit一步法反转录试剂盒
货号 规格 销售价
MF051-01 50T 798.00
MF051-04 200T 2898.00
  • M5 HiPer One-step RT-PCR Kit

    一步法反转录试剂盒(升级版)

    使用说明书

     

    产品名称                    单位        货号

    M5 HiPer One-step RT-PCR Kit    50T       MF051-01

    M5 HiPer One-step RT-PCR Kit   200T       MF051-04

     

     

     

    储存条件

     

    长期保存,请置于-20˚C,有效期12个月。使用后请及时放入-20˚C保存以保证酶的活性。

     

     

     

    产品简介

     

    本试剂盒是专为一步法RT-PCR实验研制,逆转录和PCR在同一反应体系中进行,反应过程中无需添加试剂,无需打开管盖,在避免污染的同时提高了检测灵敏度和实验效率。本试剂盒包括全新高效逆转录酶、快速热启动DNA聚合酶,同时包含适用于逆转录和PCR扩增的反应缓冲液和实验中所必需的其它组分。SuperRT逆转录酶RNase H活性缺失,减少了逆转录反应中RNA的降解。该逆转酶逆转录效率高,可对少量RNA模板进行良好的逆转录反应。PCR反应使用的快速热启动DNA聚合酶具有扩增效率高、特异性强、延伸速度快的优良性能。独特的缓冲体系使逆转录酶和聚合酶同时发挥最大功效。使用本试剂盒扩增得到的目的产物3′端附有一个″A″碱基,可直接用于T/A克隆。

     

     

     

    产品组分

                                     50T       200T

    SuperRT OneStep EnzymeMix     25 μl     100ul

    2×SuperRT OneStep Buffer       0.7 ml    2x1.4 ml

    RNase-Free Water              0.75ml    2x1.5 ml

     

     

     

    注意事项

     

    1.在操作过程中应避免RNase污染,防止RNA降解或实验中的交叉污染,建议在专门的区域进行RNA操作,使用专门的仪器和耗材,操作人员带口罩和一次性手套并经常更换手套。

     

    2.实验尽量使用一次性塑料器皿,若使用玻璃器皿,应使用0.1%DEPC(焦碳酸二乙酯)水溶液在37℃处理12小时,并在120℃下高压灭菌30分钟后使用,或者将玻璃器皿在180℃下干热灭菌60分钟后使用。实验中用到的无菌水应使用0.1%的DEPC处理后进行高压灭菌。

     

    3.本试剂盒中的所有试剂使用前请上下颠倒轻轻混匀,尽量避免起泡,并经短暂离心后使用。所涉及的酶类使用后应尽快放回-20℃,避免反复冻融。

     

    4.本试剂盒必须使用特异性引物,引物的选择可根据具体实验来选择,引物设计的好坏直接影响到RT-PCR 反应的结果,设计引物时需考虑GC含量,引物长度,引物位置,PCR产物的二级结构等因素,建议采用专业的引物设计软件来设计。

     

     

     

     

     

     

     

    操作流程

     

    1.将RNA模板、引物、OneStep RT-PCR Buffer、SuperRT OneStep RT-PCR Enzyme Mix和RNase-Free Water溶解并置于冰上备用。

     

    2.向冰浴中预冷的无RNase反应管中加入下表中试剂,至终体积25 μl:

     

    试剂              25 μl反应体系       终浓度

     

    2×SuperRT OneStep Buffer      12.5 μl            1×

    Forward Primer,10 μM            1 μl          0.4 μM

    Reverse Primer,10 μM            1 μl          0.4 μM

    SuperRT OneStep Enzyme M ix   0.5 μl

    RNA Template                    X μl        1 pg – 1 μg

    RNase-Free Water           up to 25 μl

     

    注意:引物浓度请以终浓度0.1-1.0 μM作为设定范围的参考。扩增效率不高的情况下,可提高引

    物的浓度;发生非特异性反应时,可降低引物浓度,由此优化反应体系。

     

    1. 涡旋震荡混匀,短暂离心,将溶液收集到管底。

     

    4.将热循环仪预热到45℃,将PCR管置于热循环仪中,进行RT-PCR反应。

     

    反应条件:

     

    步骤          温度         时间

    反转录        45℃        30 min

     

    PCR预变性   95℃         2 min

     

    以下30-40个循环

    变性          94℃         30 s

    退火         55-65℃       30 s

    延伸          72℃         30 s

     

    终延伸        72℃         5 min

     

     

    注意:1)一般PCR实验中退火温度比扩增引物的熔解温度Tm低5℃,退火时间一般为20-30秒,无法得到理想的扩增效率时,适当降低退火温度;发生非特异性反应时,提高退火温度,由此优化反应条件。

     

    2)延伸时间根据扩增的片段大小设定,本产品中包含的DNA Polymerase扩增效率为1 kb/30s。

     

    3)可根据扩增产物的下游应用设定循环数。循环次数太少,扩增量不足;循环次数多,错配机率会增加,非特异性背景严重。所以,在保证产物得率的前提下,应尽量减少循环次数。

     

     

    5.反应结束后取5 μl反应产物,加入适量上样缓冲液后进行电泳检测结果。

     

     

     

    备注

    本产品仅供科研使用。在确认产品质量出现问题时,本公司承诺为客户免费更换等量的质量合格产品。